Come fa un singolo ovulo fecondato a generare in pochi giorni cellule specializzate come quelle della pelle, del cervello e del sangue, ciascuna destinata a ruoli specifici come la formazione dei reni o della pelle?
Questo enigma, che ha affascinato i biologi dello sviluppo per oltre un secolo lasciando incomplete le “mappe genealogiche” cellulari, potrebbe essere finalmente risolto grazie a LoxCode. Questo strumento innovativo, sviluppato da un team australiano, promette di rivoluzionare la nostra comprensione della differenziazione cellulare.
L’enigma della specializzazione cellulare e la soluzione di LoxCode
LoxCode funziona etichettando ogni cellula di un embrione di topo con un tag di DNA univoco. Questo permette di seguire i discendenti di ogni cellula durante la formazione dei tessuti. Il dottor Tom Weber del Walter and Eliza Hall Institute ha spiegato che questo crea un “codice a barre tracciabile”, consentendo un’osservazione dettagliata e senza precedenti di questo processo fondamentale.
Il suo funzionamento si basa su un meccanismo molecolare incredibilmente ingegnoso che sfrutta l’enzima ricombinasi Cre. Questo enzima ha la capacità di riconoscere specifiche sequenze di DNA, chiamate siti loxP, e di “tagliare e incollare” frammenti di DNA tra questi siti. Nel contesto di LoxCode, la ricombinasi Cre agisce su brevi cassette di DNA predefinite. Queste cassette sono progettate per subire riarrangiamenti unici quando attivate dall’enzima, mescolando i loro segmenti interni.
Questo processo di riarrangiamento casuale genera un numero straordinariamente elevato di combinazioni: oltre 30 miliardi di possibili “codici a barre” unici in una singola operazione. Ogni codice a barre è, di fatto, una sequenza di DNA distintiva. Una volta generata in una cellula, questa specifica etichetta viene copiata fedelmente e trasmessa a tutte le cellule figlie durante le successive divisioni e la crescita dell’embrione.
Ciò che rende LoxCode così potente è la sua capacità di retroingegneria. Dopo lo sviluppo dell’embrione, gli scienziati possono prelevare campioni di tessuto e, attraverso un semplice sequenziamento del DNA, leggere i codici a barre presenti in ciascuna cellula. Confrontando questi codici, è possibile ricostruire gli alberi genealogici delle cellule con una precisione senza precedenti.
Questa ricostruzione permette di risalire all’origine di ogni cellula specializzata, rivelando le linee di discendenza e svelando così i complessi meccanismi che governano la loro differenziazione e il loro destino all’interno dell’organismo. È come avere una cronologia genetica completa per ogni singola cellula, offrendo una visione dettagliata di come si sviluppano e si specializzano le diverse parti del corpo.
Il destino cellulare rivelato precemente
I test pilota condotti con LoxCode hanno offerto approfondimenti senza precedenti sullo sviluppo embrionale. Il team ha iniettato la cassetta con il codice a barre nel quinto giorno e mezzo di gravidanza, un momento cruciale in cui l’epiblasto inizia a organizzare i suoi primi foglietti germinali. Solo una settimana dopo, i ricercatori hanno recuperato i feti e analizzato i “tag” sia nel tessuto in massa che con una risoluzione a livello di singola cellula.
Questa analisi ha rivelato che il “bias del destino” delle cellule si manifesta molto prima di quanto i libri di testo suggeriscano, come ha spiegato il Professor Shalin Naik, responsabile del laboratorio presso il WEHI. È emerso che alcuni cloni cellulari si sono distribuiti in ogni angolo dell’embrione, mentre altri sono rimasti specificamente legati all’ectoderma, al sangue o agli abbozzi degli arti.
Inserendo i dati del codice a barre in un modello computazionale basato su agenti, i ricercatori sono stati in grado di prevedere asimmetrie precedentemente nascoste, come la distinzione tra i precursori del rene sinistro e quelli del rene destro. Queste previsioni sono state successivamente confermate sperimentalmente, rafforzando la certezza che i tag di LoxCode registrano effettivamente la biologia cellulare e non semplici artefatti di sequenziamento.
LoxCode si distingue notevolmente dai precedenti sistemi di tracciamento del lignaggio cellulare. I metodi precedenti si basavano spesso su virus o tagli CRISPR, i quali presentavano limitazioni significative. Tali tecniche potevano potenzialmente danneggiare le cellule o tralasciare rami sottili negli alberi genealogici cellulari.
Ad esempio, un sistema di registrazione basato su CRISPR riusciva a catturare solo poche centinaia di modifiche uniche in un intero pesce zebra, compromettendo la risoluzione e la completezza delle informazioni ottenibili. LoxCode, invece, offre una risoluzione e una precisione molto superiori, aprendo nuove frontiere nello studio dello sviluppo embrionale.
Bias del destino cellulare: nuove scoperte
Si tratta di un’innovazione significativa nel campo della biologia dello sviluppo, superando i limiti dei precedenti metodi di tracciamento cellulare. Il suo meccanismo si basa sull’utilizzo di tredici brevi frammenti di DNA, disposti in modo tale che l’enzima Cre ricombinasi possa mescolarli in una moltitudine di combinazioni diverse. Questo rimescolamento prosegue fino a quando i frammenti raggiungono dimensioni più piccole e stabili, bloccando così il “tag” di DNA unico in posizione per ogni cellula. La brevità di questi frammenti rende i tag facilmente leggibili con gli strumenti di sequenziamento genetico standard, rendendo il metodo accessibile anche a laboratori con risorse limitate.
Il team di ricerca ha inoltre sviluppato una razza speciale di topi, il ceppo 037677, ora disponibile presso il Jackson Laboratory. I ricercatori possono utilizzare questo ceppo accoppiandolo con un altro topo che attiva il processo di codifica a barre in tessuti specifici, permettendo studi mirati sulla differenziazione cellulare.
I nuovi dati ottenuti con LoxCode hanno rivoluzionato la comprensione del destino cellulare. Contrariamente alla convinzione diffusa che le cellule pluripotenti attendessero segnali esterni prima di specializzarsi, le ricerche mostrano che molti cloni tendono già verso un solo foglietto embrionale quando il feto è ancora minuscolo.
Per esempio, le cellule dell’epiblasto situate vicino alla prima linea di formazione hanno prodotto prevalentemente cellule del sangue e del mesenchima, confermando studi precedenti ma aggiungendo una risoluzione a singola cellula. Al contrario, i cloni posizionati anteriormente hanno favorito lo sviluppo dei tessuti neurali, suggerendo che gli indizi di posizione si traducono in una predisposizione del lignaggio prima dell’inizio della gastrulazione.
Sono emerse anche asimmetrie inaspettate, come il fatto che l’abbozzo dell’arto sinistro spesso deriva da fondatori cellulari diversi rispetto a quello destro. Questo suggerisce che la casualità, e non la simmetria speculare, possa essere alla base del primo progetto scheletrico e potrebbe chiarire perché alcune patologie congenite colpiscono solo un lato del corpo.
LoxCode offre mappe di riferimento preziose per gli ingegneri delle cellule staminali, guidando la crescita equilibrata degli organoidi. Dato che il sistema funziona nei topi vivi, i ricercatori stanno già adattando il codice a barre per studiare lo sviluppo immunitario, la rigenerazione intestinale e la recidiva tumorale.
Un neuroscienziato dell’Università del Queensland sta utilizzando LoxCode per marcare i progenitori neuronali al margine di una lesione dopo un ictus, studiando come i neuroni neonati si integrano nei circuiti degli adulti. I biologi oncologi intendono monitorare l’emergere di cloni resistenti alla terapia durante mesi di esposizione ai farmaci. Ripercorrendo ogni cellula sopravvissuta fino al suo codice a barre più antico, sperano di individuare le vulnerabilità prima di una ricaduta.
In futuro, gli sviluppatori di farmaci potrebbero selezionare composti in grado di deviare linee genetiche dannose verso destini sani. Questo approccio si integra naturalmente con i profili di RNA a singola cellula, rivelando non solo la direzione di un clone, ma anche come i suoi programmi genetici si modificano nel tempo.
I disturbi dello sviluppo, spesso causati da decisioni errate delle cellule settimane prima della comparsa dei sintomi clinici, potrebbero essere meglio compresi. Con un grafico di ascendenza cellulare a disposizione, i ricercatori potranno individuare il primo errore e progettare interventi precisi. Terapie geniche che sostituiscono il DNA difettoso nelle cellule fondatrici potrebbero correggere un intero lignaggio anziché trattare i tessuti singolarmente. Allo stesso modo, i medici che si occupano di trapianti potrebbero verificare che gli innesti coltivati in laboratorio contengano la giusta miscela di tipi di cellule prima dell’intervento chirurgico.
Questioni etiche sorgeranno, in particolare se in futuro gli embrioni umani verranno etichettati con la stessa profondità. Per ora, l’attenzione rimane focalizzata sui topi, dove LoxCode promette già di riscrivere i manuali sui modelli embrionali precoci.
Lo studio è stato pubblicato sulla rivista Cell.
